Οι γονείς του αναγνώρισαν νωρίς το μουσικό του ταλέντο και έτσι ξεκίνησε την πρώτη του μουσική εκπαίδευση στο σχολείο του χωριού από το 1847, σε ηλικία 6 ετών. Από το 1857 ως το 1859 φοίτησε στην Εκκλησιαστική Σχολή της Πράγας, και σταδιακά εξελίχθηκε σε ολοκληρωμένο βιολιστή και βιολίστα. Όλη την διάρκεια της δεκαετίας του 1860 έπαιζε βιόλα στην Επαρχιακή Θεατρική Ορχήστρα της Βοημίας, την οποία από το 1866 διηύθυνε ο Μπέντριχ Σμέτανα. Η ανάγκη του να συμπληρώσει το εισόδημά του διδάσκοντας του περιόριζε τον ελεύθερο χρόνο και έτσι το 1871 παραιτήθηκε από την ορχήστρα για να μπορεί να συνθέτει. Εκείνη την περίοδο ερωτεύτηκε μία από τις μαθήτριές του, την Γιοζεφίνα Τσερμάκοβα και έγραψε για αυτήν τον κύκλο τραγουδιών «Κυπαρίσσια». 

Εκείνη περίπου την περίοδο άρχισε ο Ντβόρζακ να αναγνωρίζεται ως σημαντικός συνθέτης. Έγινε οργανίστας στον ναό του Αγίου Άνταλμπερτ στην Πράγα, ενώ μπήκε σε μία παραγωγική περίοδο σύνθεσης. Το 1875 συνέθεσε το δεύτερο του κουιντέτο εγχόρδων και το 1877 ο κριτικός Έντουαρντ Χάνσλικ τον πληροφόρησε ότι η μουσική του τράβηξε την προσοχή τουΓιοχάνες Μπραμς, με τον οποίο έγιναν αργότερα φίλοι. Ο Μπραμς επικοινώνησε με τον μουσικό εκδότη Σίμροκ, ο οποίος ως εκ τούτου παρήγγειλε στον Ντβόρζακ το πρώτο σετ Σλαβονικών Χορών, οι οποίοι εκδόθηκαν το 1878 με άμεση επιτυχία. Το «Stabat Mater» του παρουσιάστηκε στο εξωτερικό και μετά από επιτυχείς παραστάσεις στο Λονδίνο το 1883, ο Ντβόρζακ προσκλήθηκε να επισκεφθεί την Αγγλία όπου και εμφανίστηκε με μεγάλη επιτυχία το 1884. Η 7η Συμφωνία του γράφτηκε στο Λονδίνο και πρωτοπαρουσιάστηκε εκεί το 1885. Επισκέφθηκε την Αγγλία συνολικά 9 φορές συχνά διευθύνοντας εκεί ο ίδιος τα έργα του. Το 1890, επηρεασμένος από τον Πιότρ Ιλίτς Τσαϊκόφσκι επισκέφθηκε και την Ρωσία, και διηύθυνε ορχήστρες στην Μόσχα και την Αγία Πετρούπολη. Το 1891 έλαβε τιμητικό τίτλο από το Πανεπιστήμιο του Κέμπριτζ και το Ρέκβιεμ (Ντβόρζακ) του πρωτοπαρουσιάστηκε στο Τριετήσιο Μουσικό Φεστιβάλ του Μπέρμιγχαμ.

Κατά την διάρκεια των τελευταίων ετών της ζωής του ο Ντβόρζακ αφοσιώθηκε στην σύνθεση όπερας και μουσικής δωματίου. Το 1896 επισκέφθηκε το Λονδίνο για τελευταία φορά για να παραστεί στην πρεμιέρα του Κονσέρτου του για βιολοντσέλο σε Σι ελάσσονα. Το 1897 η κόρη του παντρεύτηκε τον μαθητή του, Γιόζεφ Σουκ. Διαδέχτηκε τον Αντονίν Μπένεβιτς ως διευθυντής του Ωδείου της Πράγας από το 1901 μέχρι τον θάνατό του από καρδιακή ανεπάρκεια το 1904

Τα 60α του γενέθλια είχαν εορταστεί ως εθνικό γεγονός.