Μετά την εκδήλωση της γερμανικής επίθεσης κατά της χώρας μας στις 6 Απριλίου του 1941, ο Τσολάκογλου αναγκάστηκε να δώσει σκληρό διμέτωπο αγώνα. Όταν η κατάσταση έφθασε σε οριακό σημείο και ο ελληνικός στρατός κινδύνευε να κυκλωθεί, πήρε την πρωτοβουλία να συνθηκολογήσει, παρά τις σαφείς και κατηγορηματικές διαταγές του βασιλιά, της κυβέρνησης και του γενικού επιτελείου, για αγώνα μέχρις εσχάτων. Υπέγραψε με τους Γερμανούς δύο πρωτόκολλα παράδοσης (20 και 21 Απριλίου 1941) και ένα στις 23 Απριλίου, στο οποίο συμμετείχαν και οι Ιταλοί. Στα «Απομνημονεύματά» του, που κυκλοφόρησαν το 1959, ο Τσολάκογλου υποστηρίζει ότι η συνθηκολόγηση ήταν επιβεβλημένη, εξαιτίας των «αδικαιολόγητων ελλείψεων» του Στρατού και για να αποτραπεί η αιχμαλωσία του.

Ακολούθως, ο Τσολάκογλου δέχθηκε να σχηματίσει την πρώτη κατοχική κυβέρνηση και να αναλάβει την πρωθυπουργία για την προστασία του ελληνικού λαού από τα δεινά που τον ανέμεναν, όπως υποστήριξε. Η ορκωμοσία του έγινε στις 30 Απριλίου, ενώπιον ενός απλού ιερέα και όχι του αρχιεπισκόπου Αθηνών Χρύσανθου, ο οποίος αρνήθηκε να παραστεί στην τελετή, χαρακτηρίζοντας την ενέργειά του «πράξη αντεθνική, στην οποία η Εκκλησία δεν είναι δυνατόν να δώσει τον όρκο και την ευλογία της». 

Το βράδυ της ίδιας ημέρας, ο Τσολάκογλου απηύθυνε ραδιοφωνικό διάγγελμα προς τον ελληνικό λαό και κατηγόρησε την ευρισκομένη στην Κρήτη κυβέρνηση Τσουδερού, ότι «ετράπη εις φυγήν» και δεν έχει το δικαίωμα να απαιτεί από τους Έλληνες θυσίες, που θα ισοδυναμούσαν με σφαγιασμό και αυτοκτονία. Υποσχέθηκε ότι θα εξασφαλίσει βοήθεια για τα θύματα του πολέμου και θα αναπτύξει την κοινωνική πρόνοια, αλλά δεν έκανε το παραμικρό για την αντιμετώπιση του φοβερού χειμώνα του 1941-1942 με τον λιμό, που αποδεκάτισε τον πληθυσμό των αστικών κέντρων. Ούτε απέτρεψε την κατάληψη της Ελλάδας από τις ηττημένες ιταλικές δυνάμεις και την παράδοση της Ανατολικής Μακεδονίας και της Θράκης στον βουλγαρικό στρατό, όπως είχε υποσχεθεί. Τελικά, ο Τσολάκογλου περιέπεσε σε δυσμένεια και οι Γερμανοί κατακτητές τον αντικατέστησαν με τον αντιπρόεδρο της κυβέρνησής του, Κωνσταντίνο Λογοθετόπουλο, στις 2 Δεκεμβρίου του 1942.

Αμέσως μετά την αποχώρηση των Γερμανών από την Αθήνα (12 Οκτωβρίου 1944), ο Τσολάκογλου συνελήφθη και οδηγήθηκε στις φυλακές Αβέρωφ. Με τη Συντακτική Πράξη 6/1945 παραπέμφθηκε στο Ειδικό Δικαστήριο Δοσιλόγων να δικαστεί για τη συνθηκολόγηση και τη συνεργασία με τον εχθρό. Η δίκη του άρχισε στις 21 Φεβρουαρίου του 1945 και ολοκληρώθηκε στις 21 Μαΐου με την καταδίκη του σε θάνατο. Στις 19 Αυγούστου του 1945, το Συμβούλιο Χαρίτων, κατόπιν προσφυγής του, μετέτρεψε την εσχάτη των ποινών σε ισόβια δεσμά, καθώς του αναγνώρισε το ελαφρυντικό της στρατιωτικής του προσφοράς προς το Έθνος.